primer5 是由加拿大 Premier 公司开发的一款引物设计软件，v5.0 版本适合专业人员完成 PCR、测序引物以及杂交探针的设计工作。它把序列编辑、引物设计、酶切分析和纹基分析等多个功能窗口整合在一起，让用户能较快得到引物分析结果。软件还能根据模板 DNA 的来源，按对应的遗传密码规则转换 DNA 与氨基酸序列。它的引物自动搜索功能表现优秀，同时支持部分指标分析，上手也比较容易，在引物设计领域被不少从业者视为一款相当不错的工具。
1、引物设计、限制性内切酶位点分析、DNA 基元(motif)查找和同源性分析构成了这款软件的四个主要功能模块，其中前三个是日常使用频率最高的部分。除了这四项之外，它还附带了一些辅助性功能，简并引物设计是其中比较重要的一个，序列"朗读"、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等也包含在内。
2、针对不同来源的模板 DNA，软件可以按照对应的遗传密码规则来完成 DNA 和氨基酸序列之间的转换。可供选择的生物亚结构遗传密码规则一共八种，分别是纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear)、无脊椎动物线粒体(Invertebrate Mitochondrion)、支原体(Mycoplasma)、植物线粒体(Plant Mitochondrion)、原生动物线粒体(Protozoan Mitochondrion)、一般标准(Standard)、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mito-chondrion)和酵母线粒体(Yeast Mitochondrion)。
一、限制性酶切点分析及基元查找功能
1、主界面把主要功能都摆得很直观，用起来不费劲。限制性酶切点分析和基元查找这两块操作不复杂，点开对应按钮，挑好要用的限制性内切酶或者基元（像-10序列、-35序列这类），确认一下就完成了。
2、常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到,你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元
常规的限制性内切酶与基元基本都能检索到，同时你也能修改或新增自己需要的限制性内切酶和基元。二、引物设计
1、在DNA序列界面中按下primer按钮，就会弹出一个名为“search criteria”的窗口，里面提供了多个可调节的参数选项。
2、软件提供三种搜索目标选择：PCR引物、测序引物和杂交探针，方便按需定位。
3、搜索类型可以设置为单独查上游或下游引物，也能同时查两者，或者直接按成对引物来搜，甚至还能分别以适配上游、适配下游为主。搜索范围、引物长度、搜索方式以及各项参数也都能按需调整。
4、使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按search，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按OK，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物(Sense)，下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序(Rating)排列，满分为100，即各指标基本都能达标
使用前可以按自己的需求调整各项参数，没有特别要求的话直接用默认值就行。点search后，Search Progress 窗口里出现Search Completed 时再按OK，结果就会以表格形式列出来，有上游引物(Sense)、下游引物(Anti-sense)和成对显示(Pairs)三种查看方式，默认是成对显示，并按Rating从优到劣排序，满分100，代表各项指标基本都符合要求。
1、点一下任意一对引物，比如第1#引物，然后把刚才那个窗口移开或关掉，就能看到“Peimer Premier”主界面，结果会分成三块显示。
2、界面布局上，模板与扩增产物各占一处，引物对的核心参数列在中间区域，底部则集中展示四项关键评估结果：发夹结构、二聚体、错误引发以及上下游引物间的交叉二聚体情况。
3、如果待分析的引物可能形成四种结构，那个按钮会切换显示状态，点一下它，左下角窗口里就会显示出对应的结构生成结果。
4、一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度
最理想的引物不应带有前面提到的任何一种结构，所以最理想的结果就是最下方那栏完全空白、没有任何提示。中间一栏的末尾会标出这条引物最适合的退火温度，这处信息值得留意。四、引物修饰编辑
1、如果需要给引物加上修饰，比如在5'端插入酶切位点，点一下对应按钮就能直接改动引物序列。
2、想回到搜索结果页面，点一下对应按钮就行。要是需要设计简并引物，先看源氨基酸序列来自哪个物种，再从前面提到的八种遗传密码规则里挑一种，倒推出DNA序列就完成了。
3、针对简并引物的分析，要求不像普通引物那样严苛。
4、Premier 这款软件能自动查找引物，还支持对部分指标做分析，用起来也顺手，整体表现挺让人满意。
获得基因序列后，打开primer 5.0 点击File-new-DNA sequence 粘贴cDNA序列-as is-ok 点primer 点search-调整如图参数（产物长度一般为100-300，引物长度一般为20左右，视情况调整） 点ok，弹出的新窗口也点Ok 弹出窗口后，先看右边，根据系统设计的引物进行筛选，优先评分较高的 注：S是上游引物，A是下游引物，sense，anti-sense最好都是None，再细看 ①ΔG绝对值小于10 ②tm在58左右，正负2度 ③GC%在40%-60% ④末端不能是A ⑤不能有连续3个相同的碱基 ⑥3’端一定不能有错配 【筛选原则】：
1、该软件没有hairpin、dimer和false priming。
2、尽量避免出现连续相同的碱基，例如TTT或GGG这类重复片段。
3、设计引物时，两条引物之间的碱基对数量差异最好控制在2个以内。
4、这款工具能把PDF文件拆分成多个小文件，操作时你可以自己设定按页数切分，还是按份数切分。拆分完成后，还能把得到的几个小文件重新合并成一个完整的PDF。
5、该温度通常维持在58度上下，波动范围不超过正负2度。
6、一般设计时引物18-22长度，最长不要超过25
设计引物时通常取18到22个碱基的长度，上限控制在25个以内。，引物的3’端最后一个碱基应避免是A。
8、出现Found时，ΔG绝对值小于10
当出现Found时，若ΔG绝对值不到10，说明引物二聚体或发夹结构的风险较低。由于基因序列本身存在差异，通常很难让所有原则都同时满足，但可以针对系统给出的前几对引物做微调，尽量贴近这些原则。
病理检测引物设计：能在高保区域完成引物设计
等位基因特效引物：针对某一类相关序列中的特定成员，设计专用扩增引物
种间交叉引物设计：来自多个物种的序列来设计扩增引物
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